El proceso de replicación del ADN que permite la duplicación del material genético de un organismo se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservador, es decir, dos cadenas complementarias del ADN original, sirven de molde cada una para sintetizar una nueva cadena, a su vez complementaria de la cadena molde. El resultado final es una nueva cadena doble hélice que contiene una de las cadenas del ADN original.
La replicación empieza en puntos denominados orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma.
La síntesis de la nueva cadena de ADN es llevada a cabo por ADN polimerasas, que emparejan los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con los desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN molde. Los dNTP que se usan en la replicación del ADN contienen tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5" de la desoxirribosa y dependiendo de la base nitrogenada serán dATP, dTTP, dCTP o dGTP. La reacción fundamental es una transferencia de un grupo fosfato en la que el grupo 3"-OH actúa como nucleófilo en el extremo 3" de la cadena que está en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosfato α (el más próximo a la desoxirribosa) del desoxirribonucleósido 5" trifosfato que entra, liberándose pirofosfato inorgánico y alargándose el ADN.
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